Nature｜上海科學(xué)家團隊建立干細胞類胚胎模型，揭示靈長類胚胎發(fā)育“神秘時刻”
2025年12月3日，nature期刊在線發(fā)表了題為《modeling late gastrulation in stem-cell derived monkey embryo models》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心/上海腦科學(xué)與類腦研究中心劉真研究員聯(lián)合腦智卓越中心孫強研究員、西班牙龐培法布拉大學(xué)alfonso martinez-arias教授和西北農(nóng)林科技大學(xué)王小龍教授合作完成。
該研究首次利用干細胞類胚胎模型，實現(xiàn)了體外模擬靈長類晚期原腸運動發(fā)育過程，并重現(xiàn)原腸運動階段的關(guān)鍵發(fā)育事件，為深入理解靈長類早期胚胎發(fā)育機制，及發(fā)育異常引起的早發(fā)流產(chǎn)和出生缺陷提供了強大的創(chuàng)新研究范式。
著名的發(fā)育生物學(xué)家劉易斯?沃伯特（lewis wolpert）曾指出，人一生中最重要的時刻不是結(jié)婚、出生或死亡，而是原腸胚的形成。生命最初的“形態(tài)構(gòu)建”——原腸運動，是胚胎發(fā)育中最關(guān)鍵也最神秘的階段之一。在此期間，著床后的囊胚細胞團經(jīng)歷劇烈的細胞命運分化、位置遷移與形態(tài)發(fā)生，形成內(nèi)、中、外三個胚層，從而奠定胎兒所有組織器官發(fā)育分化的基礎(chǔ)。人類孕育過程中多數(shù)早期流產(chǎn)與嚴重出生缺陷源于此階段的異常。然而，由于該階段體內(nèi)胚胎獲取困難、體外胚胎培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸以及嚴格的“14天”倫理限制，導(dǎo)致領(lǐng)域內(nèi)對于靈長類原腸運動這一“黑匣子”的發(fā)生規(guī)律及其調(diào)控機制研究尚處于起步階段。
類胚胎模型，是指近年來利用多能干細胞在體外進行誘導(dǎo)和組裝而獲得的一類可以高度模擬正常胚胎形態(tài)發(fā)生、譜系組成和基因表達特征的胚胎結(jié)構(gòu)。相較于利用正常胚胎開展研究，類胚胎模型具有方便獲取、易于基因操作、倫理爭議少等優(yōu)勢，這為深入理解和研究靈長類著床后原腸運動提供了重要契機。目前小鼠干細胞來源的類胚胎已經(jīng)能在體外培養(yǎng)發(fā)育至早期器官發(fā)生階段。盡管全世界各地多個研究團隊嘗試利用人多能干細胞開展類似研究，但尚未有研究報道利用人干細胞類胚胎模型實現(xiàn)原腸運動的完整模擬。已有的研究表明，干細胞多向發(fā)育潛能的高效維持和穩(wěn)定培養(yǎng)是類胚胎模型誘導(dǎo)的關(guān)鍵。劉真研究員專注于靈長類胚胎發(fā)育、干細胞和模型構(gòu)建研究。2023年，劉真研究團隊針對靈長類多能干細胞發(fā)育潛能展開系統(tǒng)研究，與合作者首次獲得高比例胚胎干細胞來源的嵌合體猴（cell, 2023）。在此基礎(chǔ)之上，劉真研究團隊與合作者成功利用猴胚胎干細胞誘導(dǎo)獲得了猴“類囊胚”結(jié)構(gòu)，并證明獲得的類囊胚結(jié)構(gòu)具有體外發(fā)育至早期原腸胚階段（day 17）的發(fā)育潛能（cell stem cell，2023），但當時的研究中類囊胚體外培養(yǎng)發(fā)育效率較低，未能真正突破原腸運動階段。
本研究中，研究團隊首次利用干細胞類胚胎模型，完整模擬了靈長類晚期原腸運動發(fā)育過程，并體外重現(xiàn)原腸運動階段的關(guān)鍵發(fā)育事件。研究團隊首先對類囊胚的誘導(dǎo)流程和相關(guān)參數(shù)進行了系列改進，高效穩(wěn)定誘導(dǎo)猴干細胞類囊胚結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)之上，通過將原先的體外培養(yǎng)系統(tǒng)從2d培養(yǎng)改進到3d懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)干細胞來源的猴類囊胚可以高效、穩(wěn)健地發(fā)育至day 17早期原腸期胚胎（從之前的4%提升到40%左右），這為進一步開展胚胎培養(yǎng)并改進培養(yǎng)參數(shù)提供了可能。該體系能夠連續(xù)模擬靈長類囊胚早期著床后（d11）到早期原腸胚階段（d17）的胚胎動態(tài)發(fā)育過程，形成由上胚層（epiblast）、羊膜腔（amnion cavity）和卵黃囊腔 （yolk sac cavity）構(gòu)成的靈長類早期原腸胚階段典型雙層胚盤樣結(jié)構(gòu)。
研究團隊測試了不同培養(yǎng)條件促進day17猴干細胞類胚胎進一步發(fā)育的效果，發(fā)現(xiàn)在特定時間加入梯度濃度胎牛血清可以促進胚盤進一步發(fā)育至day25，同時保持胚盤結(jié)構(gòu)的清晰和持續(xù)發(fā)育，包括day20時期的顯著的胚盤拉長和day23時期的胚盤彎曲等典型的形態(tài)變化過程（圖1a-c），類似天然胚胎的卡內(nèi)基第8-9階段（cs8-9），即原腸運動的晚期及早期器官發(fā)生的起點。通過進一步的組織形態(tài)學(xué)和單細胞轉(zhuǎn)錄組特征鑒定，這些體外培養(yǎng)的“猴類胚胎”在形態(tài)和細胞組成上，與相應(yīng)發(fā)育階段的天然猴胚胎高度相似（圖1d）。它們不僅能模擬靈長類早期原腸胚期間前后軸、原條、羊膜腔和卵黃囊腔等典型結(jié)構(gòu)的形態(tài)發(fā)生，更重現(xiàn)了原腸運動后期的多個關(guān)鍵發(fā)育事件，包括神經(jīng)板（neural plate, np）的形成和早期神經(jīng)褶樣結(jié)構(gòu)（neural groove, ng）的出現(xiàn)（圖1e-f），揭示了靈長類大腦和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的最初“藍圖”；新生中胚層（nas.meso）、側(cè)板中胚層（lateral plate mesoderm）以及心臟中胚層（cardi.meso）等高級中胚層譜系的分化和早期卵黃囊造血系統(tǒng)的發(fā)育。猴類胚胎在卵黃囊樣結(jié)構(gòu)中啟動了原始造血，產(chǎn)生了包括內(nèi)皮細胞、造血祖細胞以及紅細胞在內(nèi)的多種血液細胞；定型內(nèi)胚層（definitive endoderm, de）的分化，形成了前腸 （foregut）和后腸 (hindgut) 的原始結(jié)構(gòu)，以及尿囊等，為消化、呼吸等多種器官的發(fā)育奠定了基礎(chǔ)；成功特化了原始生殖樣細胞（primordial germ cell-like cells, pgclcs），并追蹤了其從羊膜向胚胎后部遷移的路徑，高度模擬靈長類pgc細胞體內(nèi)動態(tài)發(fā)育的過程。全面的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序分析證實，這些類胚胎內(nèi)部的細胞類型、基因表達譜以及細胞分化路徑，與同期的自然胚胎高度吻合（圖1g-h），從分子層面證明了該模型的可靠性。
為進一步驗證該模型的實用性和可靠性，研究團隊利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了tbxt和eomes基因敲除的猴類胚胎模型。這兩個基因是啟動原腸運動的關(guān)鍵調(diào)控因子。研究人員發(fā)現(xiàn)tbxt敲除導(dǎo)致類胚胎的胚盤縮短、體軸發(fā)育紊亂，中胚層和內(nèi)胚層分化嚴重受損，這與其在小鼠中的功能保守，并首次在靈長類模型中揭示了其作用機制。eomes敲除則嚴重影響了類囊胚的形成，揭示了說明其在靈長類滋養(yǎng)層發(fā)育中的發(fā)揮關(guān)鍵作用?；诤镱惻咛ツＰ蜆?gòu)建的crispr基因擾動系統(tǒng)，突破了傳統(tǒng)模式生物研究的局限性，為體外系統(tǒng)性地解析靈長類胚胎發(fā)育尤其是原腸運動時期的關(guān)鍵調(diào)控基因和譜系分化規(guī)律提供了重要研究平臺范式。
圖1. (a) 猴類胚胎發(fā)育至第25天（d25）的三維懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。(b) d17至d25猴類胚胎明場圖。(c) d17至d25期間猴類胚胎發(fā)育效率統(tǒng)計。(d) e18和e19階段天然猴胚胎（上）及d18、d19猴類胚胎（下）的對比。(e) 猴類胚胎在第22天（d22）和第25天（d25）的h&e染色圖像。(f) d17-d25階段猴類胚胎的3d重構(gòu)圖。(g) umap展示猴類胚胎所有細胞類型的分布。(h)猴類胚胎與cs8-9階段天然猴胚胎的單細胞整合分析。
該工作創(chuàng)建了首個在體外完整模擬靈長類原腸運動至早期器官發(fā)生的干細胞類胚胎模型，它涵蓋了從囊胚到原腸運動完成中的的多個重要事件。未來，該模型可以直觀地“看到”靈長類生命早期構(gòu)建的過程，并深入解析其譜系發(fā)生規(guī)律和背后的調(diào)控機制，此外，也提供了一個可以進行遺傳操作和高效篩選的強大工具，用以研究發(fā)育疾病的根源并進行相關(guān)藥物的胚胎安全性測試。文章在線后，同期nature以“靈長類胚胎模型的一次飛躍”為題發(fā)表對研究的評論文章，指出該模型高度復(fù)刻了靈長類胚胎前三周的關(guān)鍵發(fā)育事件，首次提供了一個能連續(xù)觀察受孕后大約6到22天的早期靈長類發(fā)育過程的胚胎模型，使得體外按順序分析靈長類早期胚胎發(fā)生的動態(tài)復(fù)雜過程成為可能。
